维 A 酸在细胞和基因水平调控黑素表达的研究

　　刘全忠 籍晓明 张秉新 侯淑萍 元玉青 金洪喜

　　【 摘要 】 目的 探讨维 A 酸治疗皮肤色斑的作用机制。方法 应用不同浓度的维 A 酸作用于 B16Flo 黑素瘢细胞及正常人黑素细胞，观察对酪氨酸酶 mRNA 的表达、酪氨酸酶活性、黑素含量及黑素细胞增殖率的影响。结果 维 A 酸的作用浓度为 100μmol / L 时，黑素细胞酪氨酸酶 mRNA 表达下调均值为 30 . 13 % ；当浓度为 500μmol / L 以上时，可使酪氨酸酶活性降低 82 . 79 % ，并随着浓度的增加作用越明显；而对黑素含量的降低则需要更高的浓度（1000μmol / L ) ；同时，还有促进黑素细胞增殖的作用。对照组氢醌对酪氨酸酶 mRNA 的表达无明显影响，对色素细胞有抑制和毒性作用。结论 维 A 酸能够抑制黑素产生，是通过下调酪氨酸酶的表达和活性来完成。

　　［关键词］ 维 A 酸；黑素瘢细胞；黑素细胞

　　Regulation of melanin expression in both cell and gene by retinoic acid  LIU Quan-zhon " , Jl Xiao-ming ,ZHANG Bing-xin ， HOU Shu-ping , QI Yu-qing , JIN Hong -xi . ' Department of Dermatology, General Hospital , Tianjin Medical university，Tianjin300052 , China

　　[ Abstract ] objective  To investigate the effects and mechanism of retinoic acid on B16 marina mel - anoma cells and human melanocytes in vitro . Methods B16F10 murine melanoma cells and human melanocytes were cultured in culture medium which contains different concentration of components , including retinoic acid . Using reverse transcription-polyrnerase chain reaction ( RT-PCR ) mRNA expression of the tyrosinase was detected . Tyrosinase activity , melanin content and cell proliferation rate were also determined .  Results   Retinoicacid exhibited an inhibitory effect on the expression of tyrosinase mRNA . As the concentration of retinoic acid was 100 μmol / I , treating for 72h , the expression of tyrosinase mRNA decreased 30 . 13 % , retinoic acid exhibited an inhibitory effect on tyrosinase activity and melanin production at high concentration ( > 500μmol /L） , and it could promote the cell proliferation . Retinoic acid and hydroquinone could be cooperative at high concentration ( 1 000μmol / L ) , and enhanced the down regulation of tyrosinase activity and melanin content . Retinoic acid could also mitigate the inhibitory effect of hydroquinone on cell proliferation , 50 as to protect the cells from injury . Hydroquinone had no effect on tyrosinase gene expression at mRNA level . Conclusion  Retinoic acid inhibits the synthesis of melanin by the genetic regulation at mRNA level .

　　[ Key words 】 Retinoic acid ; Mechanism ; Melanocytes

　　色素性皮肤病是一类发病率非常高的疾病，不仅影响容貌，还严重地妨碍患者的心理健康，一直是皮肤病学者努力攻克的难题。在长期的临床实践中，一些皮肤病学者致力于不同药物的联合治疗，发现以适当浓度的维 A 酸和氢醌配制的外用霜剂治疗黄褐斑取得较好的效果，但具体机制尚未明了。我们试图通过对体外培养黑素瘢细胞和正常人黑素细胞的酪氨酸酶活性、黑素含量和黑素细胞增殖率的研究，并通过检测黑素细胞酪氨酸酶 mRNA 表达观察维 A 酸、氢醌的作用，对其作用机制进行初步探讨

　　材料与方法

　　一、材料

　　TRIzol 试剂盒（美国 Gibco 公司） ; M-MLV 逆转录酶（美国 Promega 公司）；氢醌（国内市售分析纯）；维 A 酸（中国华邦制药公司，分析纯）；小鼠 B16F10 黑素瘢细胞株（中国科学院上海细胞生物研究所）；二氧化碳孵育箱（美国 Forma Scientific 公司）；倒置显微镜旧本 Olympus 公司）。

　　二，方法

　　1 ．细胞培养： B16F10 黑素瘢细胞用含 10 % 牛颌血清的 RPMI1640 培养基进行培养， 37 ° C 、 5 % CO2 孵育，当生长 70 ％融合状态时用 0 . 25 ％胰蛋白酶和0.02 ％乙二胺四乙酸（ EDTA ) 进行消化传代。

　　正常人黑素细胞的培养（赵辨，黄秋玲．正常黑素细胞体外纯培养及其细胞生物学鉴定．临床皮肤科杂志， 1991 , 20 ( 5 ) : 226-228 .）：取包皮环切术皮肤标本，用 0 . 25 ％胰蛋白酶 4 ℃ 冷消化 13～14h ，重新加人 0 . 25 ％胰蛋白酶，置于 37C 温箱中热消化 30min ，加人黑素细胞培养液（主要成分为 MCDB 153 培养基，其中添加 10 ％牛颌血清、 12-0-十四烷酞拂波醇-13-醋酸醋（ TPA ) 85 nmol / L 、异丁基甲基黄嘌吟（ IBMX ) 0 . 1 mmol / L 、霍乱毒素 1 nmol / L 、青霉素 IOOU / ml 、链霉素 100 拌 g / ml ，调节细胞浓度到 5х105细胞／ ml ) , 5 % CO2 、 37℃ 培养。 2 周后传代，48h 后用添加不同药物的新鲜培养基换液 1 次，孵育 72h 后进行检测。

　　2 ．试剂配制和分组：氢醌、维 A 酸用二甲基亚砜溶解，在应用时用黑素细胞培养液调节不同浓度： 1 、5 、10 、50 、100 、500 、1 000 、5 000μ mol / L 。空白组仅加二甲基亚砜。实验分组：维 A 酸组、氢醌组、氢醌与维 A 酸联合处理组和空白对照组。

　　3 ．酪氨酸酶活性测定：制备含有活性酪氨酸酶的细胞裂解物，在 37 ℃ 预热后，将细胞裂解物一式 3 份分别加人含 0 . 1 % 3 , 4-二劷苯丙氨酸（ L-DO - PA ）的磷酸缓冲液（ PBS ) , 37°C 反应2h 。测定波长在490 nm 的吸光度值（ A490nm ）。

　　4 ．黑素含量测定：0.25 ％胰蛋白酶消化，加人适量 PBS 劷劷冲洗细胞。加人 1 mol / L NaOH 50μl ，孵育 4h 。加人双蒸水 250μl ，将 NaOH 终浓度稀释。． 2 mol / L 。测定 A405nm 值。每个处理黑素含量用 A405nm 值占空白对照A405nm值的百分率表示。

　　图 l 正常 B16F10 鼠黑素瘢细胞：呈梭形，胞体较大，胞浆丰富，均匀透明，细胞有 2～3 个树枝状突，突起较短 图 2 维 A 酸作用 72h 后的 B16F10 鼠黑素瘢细胞：略呈梭形，胞体扁平变薄，胞体增大，胞浆稀薄．部分细胞树突已不明显图 3 氢醌作用 72h 后的 B16F10 鼠黑素瘢细胞：呈多角形，胞体缩小，胞浆透明度下降，细胞间可见细胞碎片 图 4 原代培养正常人黑素细胞：胞体较小，胞浆透明度正常，细胞突起明显 图 5 维 A 酸作用 72h 后的人黑素细胞细胞：胞体较小，胞浆透明度下降，细胞突起仍明显 图 6 氢醌作用 72h 后的人黑素细胞：胞体较小，胞浆透明度下降，细胞突起已不明显 Fig 1 Normal B16F10 mouse melanoma cells are spindle , with larger cell body , cytoplasm-rich , uniformly transparent , and 2 - 3 dendritic cell protrusion , protruding significantly shorter , but bulky . Fig 2 After Victoria A acid treating the B16FIO mouse melanoma cells for 72 hours , the cells became slightly spindle-shaped , the cell body was thin and flat . Parts of the cell dendrites had become insignificant . Fig 3 After hydroquinone treating the B16FIO mouse melanoma cells for 72 hours , the cells are polygonal , the cell body reduces , the transparency of the cytoplasm decreases , and intercellular cell debris can be seen . Fig 4 Primary cultured normal human melanocytes show that the cell bodies are smaller , the transparency of cytoplasm 15 nor mal , and the cellular processes are significant . Fig 5 After Victoria A acid treating human melanocytes for 72 hours , the cell body becomes smaller , the transparency of cytoplasm decreases , and the cellular processes are still evident . Fig 6 After hy - droquinone treating human melanocytes for 72 hours , the cell bodies become smaller , the transparency of cytoplasm decreases and the cellular processes have become insignificant .
5 ．黑素细胞增殖率测定：向每孔加人 0 . 5 ％四甲基偶氮哇盐（ MTT ) 10 μL，放人含 5 % CO2 的 37 ℃ 孵育箱继续培养 4h 。吸去培养液，每孔加人 100 μl 二甲亚砜（ DMSO ) ，充分振摇 96 孔板 10 min , 使结晶溶解，测 A490nrn 光吸收值。黑素细胞增殖率用每个处理组 A490值占空白对照组 A490值的百分率来表示。6 ．细胞总 RNA 的分离与纯化：采用 TRIzol 试剂盒，通过细胞收集，细胞匀浆，液相分离， RNA 沉淀及 RNA 冲洗与再溶解等步骤分离纯化小鼠 B16FIO 黑素瘢细胞总 RNA 。7 ．逆转录聚合酶链反应（ RT-PCR ) : ( 1 ) RTPCR 引物：采用 DNAStar 软件设计，间酪氨酸上游引物 ( m –Tyr-R ) 5 ' GACACATAGTAATGCATCc3 ' ，间酪氨酸下游引物（ m-Tyr-F ) 5 ' TTcAAAGGGGTG - GATGAccG3 ' ，预期扩增片段长度 500 bp ，日肌动蛋白-RS ' TCTCTT TGATGTCACGCACG3 ' ，俘肌动蛋白-FS ' TCAGAAGGACTCCTATGTGG3 ' , 预期扩增片段长度 319 bp 。（ 2 ）逆转录反应（ RT ) 过程：将引物 Ohgo ( dT ）、总 RNA 、二乙基焦碳酸 ( DEPC ）处理水加人到离心管中，置恒温水浴箱 70 ℃ 5 min ，之后依次加人：反应缓冲液、单脱氧核苷三磷酸（ d NTP ）、 M-MLV 逆转录酶、 RNA 酶抑制剂、 DEPC 处理水，组成 25 川反应体系，放人 42 ℃ 恒温水浴箱，反应 60 min 得到 cDNA 。（ 3 ) PCR 反应条件：在 DNA 扩增仪中扩增 35 个循环： 94 ℃ 变性 1 min , 54 ℃ 退火 1 min , 72 ℃ 延伸 1min ，最后一个循环结束后 72 ' C 延伸 7 min 。（ 4 ) PCR 产物分析： PCR 扩增产物于 2 ％琼脂糖凝胶中（含 0 . 2μg / ml 嗅化乙锭）进行电泳，在凝胶扫描仪上观察结果，并用 LabworkS 3 . 0 软件对扩增产物进行吸光度分析。酪氨酸酶基因表达水平以酪氨酸酶 mRNAA 值巾肌动蛋白 mRNAA 值表示，mRNA 下调百分率（ % ）=（ 1―处理组 A 值／空白对照组 A 值）х100 ％。

　　一、统计学处处理

　　所测实验数据用δ±s，表示，采用配对计量资料进行 t 检验。统计过程使用 SPSS 统计软件完成，以P＜ 0 . 05 为差异有统计学意义。

　　结果

　　一、黑素细胞的形态学观察

　　维 A 酸和氢醒作用后的 B16F10 鼠黑素瘢细胞和人黑素细胞形态学变化见图 1-6.

　　二，维 A 酸和氢醒对黑素细胞的影响

　　1 ．对酪氨酸酶活性的影响：维 A 酸的浓度在 100μmol / L 及以下时，对黑素细胞的酪氨酸酶活性没有显著影响，当浓度在 500μmol / L 以上时，浓度越大酪氨酸酶活性下降越明显。当加人氢醒时，两者协同对酪氨酸酶活性的抑制作用比单独应用氢醒或维 A 酸均强（表 l )

　　2 ．对黑素细胞黑素含量的影响：维 A 酸浓度在 1 000μmol / L 以上时，对黑素细胞的黑素含量有明显的下调作用，浓度在 500μmol / L 及以下时，对黑素细胞的黑素含量没有显著影响。维 A 酸与氢醒共同作用与单用维 A 酸相比黑素含量显著下降，但与单用氢醒相比差异无统计学意义（表 2 ）。

　　3 ．对黑素细胞增殖率的影响：维 A 酸在 5 000μmol / L 时对黑素细胞增殖率有劷微的促增殖作用。单独应用氢醒对细胞增殖率有抑制作用，合用维 A 酸后仍主要表现为抑制作用，浓度在 100μmol / L 以上时，细胞增殖率与单独应用氢醒组相比有所升高（表 3 ）。

　　二、 维 A 酸、氢醒对小鼠 B16F10 细胞酪氨酸酶 mRNA 表达影响 1 ．维酸、氢醒对小鼠 B16F10 细胞酪氨酸酶 mRNA 表达影响的比较：将维 A 酸的作用浓度定为 10μmol / L ，作用时间为 96h ；将氢醒的作用浓度定为 10 。胖 mol / L ，作用时间定为 96h 。维 A 酸组与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01 ) , 而氢醒组与正常对照组相比差异无统计学意义 ( P > 0 . 05 ，表 4 ）。

　　2 ．维 A 酸不同作用时间对小鼠 BI6F10 细胞酪氨酸酶 mRNA 表达影响：设定维 A 酸（ 100μmol / L ) 分别作用 48 、72 、96h ，观察 mRNA 的表达。随着时间的增长小鼠 B16F10 细胞酪氨酸酶 mRNA 表达逐渐减弱，提示维 A 酸作用时间的长短对酪氨酸酶 mRNA 表达有影响（表 5 ）。

　　讨论

　　维 A 酸具有多种药理活性，可以抑制角质形成细胞的异常增殖和分化、促进其正常的角化过程；抑制皮脂腺分化和皮脂的生成；具有抗炎活性，抑制中性粒细胞的趋化性及溶酶体的释放。维 A 酸影响肤色的途径与机制、对酪氨酸酶活性的影响的机制目前尚未明了。有报道指出，在小鼠和仓鼠黑素瘢细胞的黑素诱导表达的实验中维 A 酸抑制这种诱导，维 A 酸是通过结合其特异性核受体（ RAR ）中的核受体酶（ RARE ）启动酪氨酸酶基因的表达的（Miller N , Vile RG , Hart IR . Effects of modulators of tyrosi nase on expression of rnurine interleukin-2 cDNA driven by the tyrosinase prornotor . Melanoma Res , 1995 , 5 ( 2 ) : 75-81 .），大多数维 A 酸对黑素细胞本身没有抑制，仅有个别维 A 酸（ CD437 and CD2325 ）对黑素细胞增值有抑制作用（Schadendorf D , Worm M , Jurgovsky K , et al . Effects of various synthetic retinoids on proliferation and irnmunophenotype of human melanoma cells in vitro . Recent Results Cancer Res , 1995 , 139 : 183-93 .）。

　　我们研究表明：维 A 酸在适当浓度 ( 500μmol / L 以上）时，可使酪氨酸酶活性显著降低，并随着浓度的增大作用越明显；而对黑素含量的降低则需要更高的浓度（ 1000 μmol / L ）。对黑素细胞增殖率不仅没有抑制，而且在较高浓度时 ( 5 000 μmol / L ）还有促进增殖的作用；对黑素抑制作用也不明显，说明维 A 酸治疗色素性疾病不是通过抑制黑素细胞，而是主要通过酪氨酸酶完成，且抑制酪氨酸酶的表达随作用时间的延长作用也越明显。维 A 酸对细胞酪氨酸酶 mRNA 表达有下调作用，推测所谓抑制黑素产生是通过抑制酪氨酸酶表达进而抑制酪氨酸酶活性来完成的（Ferguson CA , Kidson SH . There gulation of tyrosinase gene transeription . Pigment Cell Res , 1997 , 10 ( 3 ) : 127-138 .）。

　　氢醒作为一种广泛应用于色素增加性皮肤病的皮肤脱色剂，是直接通过作用于黑素细胞来完成的，不仅可降低黑素细胞中的黑素含量、也能降低酪氨酸酶活性，同时还能抑制黑素细胞的增殖。有研究者认为，氢醒作为酪氨酸酶的底物较酪氨酸本身更为合适，其脱色机制可能与竞争抑制酪氨酸酶活性有关。另有研究者认为，实质上是一种酪氨酸酶介导的细胞毒作用。作为对照，我们也在研究维 A 酸对细胞酪氨酸酶 mRNA 表达影响的同时，对氢醒作用于 B16F10 细胞酪氨酸酶 mRNA 表达影响也进行了研究。结果表明，其对于 B16F10 细胞酪氨酸酶 mRNA 表达没有影响。
维 A 酸与氢醒的联合实验结果表明，对酪氨酸酶活性两者一起的抑制作用比单独应用要强，两者有协同作用。对细胞增殖，维 A 酸有减少氢醒对黑素细胞的抑制作用；对黑素含量则显示合用使黑素含量下降的效果与单用氢醒没有显著性差异；而在酪氨酸酶基因转录水平，氢醒与维 A 酸不具有协同作用，酪氨酸酶 mRNA 表达的下调是维 A 酸单独作用的结果。

　　研究结果提示，维 A 酸能够同时在细胞水平和基因水平下调黑素产生，主要是通过下调酪氨酸酶的表达和活性来完成，可能是通过维 A 酸受体对酪氨酸酶基因转录进行了调控。其机制可能与一些研究相似（Orlow ST , Chakraborty AK , Pawek JM . Retionoic acid 15 a potent inhibitor of inducible pigmentation in murine and hamster melanoma cell lines . Invest Dermatol , 1990 , 94 ( 4 ) : 461-464 .冯素英，昊勤学，林麟，等．维 A 酸受体蛋白在寻常性银屑病的表达中华皮肤科杂志， 2005 , 35 ( l ) : 51-53 .） 。有关一项研究显示，外用维 A 酸乳膏可能通过 RAR-a 受体（ H 特异性核受体）的表达导致表皮细胞的增殖（吴秋菊，马鹏程，陈志强，等．外用维 A 酸后小鼠皮肤中维 A 酸受体的表达．中华皮肤科杂志， 2005 , 38 ( 7 ) : 449 -450 .7），这也可能是我们研究结果中黑素细胞增殖的机制。实验得出，维 A 酸对黑素细胞酪氨酸酶转录、酶活性、黑素含量以及细胞增殖的影响有明显的剂量相关性。